應(yīng)用案例（質(zhì)量光度計(jì)-MP）：質(zhì)量光度計(jì)表征蛋白質(zhì)相互作用的平衡態(tài)

Characterization of protein interaction equilibria

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質(zhì)量光度計(jì)定量了溶液中生物分子的質(zhì)量分布。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合物形成通常是涉及多個(gè)成分的多步驟反應(yīng)。質(zhì)量光度計(jì)是一種新的分子光譜分析方法，它可以監(jiān)測(cè)復(fù)雜的平衡反應(yīng)的形成，并評(píng)估化學(xué)環(huán)境或蛋白質(zhì)濃度的變化如何影響平衡。質(zhì)量光度計(jì)以單分子方式直接測(cè)量樣品中所有蛋白質(zhì)群體的相對(duì)濃度。

從DNA復(fù)制到細(xì)胞周期控制，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)幾乎每一個(gè)細(xì)胞過程都至關(guān)重要。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用主要是非共價(jià)的，它們通常以平衡狀態(tài)存在。評(píng)估系統(tǒng)在擾動(dòng)后如何恢復(fù)平衡，可以深入了解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，而相互作用親和力是通過測(cè)量平衡時(shí)每個(gè)組分的相對(duì)濃度來確定的。然而，當(dāng)感興趣的系統(tǒng)包括低濃度下的多個(gè)反應(yīng)或組分時(shí)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究可能變得復(fù)雜。在這些條件下，體積或平均測(cè)量值迅速下降。相比之下，質(zhì)量光度計(jì)是一種單分子分析技術(shù)，因此它可以直接測(cè)量樣本中所有組分的分子質(zhì)量和相對(duì)豐度。在這里，我們使用質(zhì)量光度計(jì)研究形成四聚體的重組蛋白的低聚過程。

表征反應(yīng)平衡的形成

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)受到干擾后，如總蛋白質(zhì)濃度的變化，系統(tǒng)會(huì)重新平衡。此處研究的重組蛋白主要在高濃度（>100μM）下形成四聚體，但我們研究了其在低nM濃度范圍內(nèi)的行為，這在生理上更為相關(guān)。將樣品稀釋至10 nM后，通過光度測(cè)定法檢測(cè)到分子量與單體、二聚體和四聚體形式相對(duì)應(yīng)的物種種群（圖1）。其他組分，如三聚體、五聚體和八聚體，也可見，但豐度較低。隨著時(shí)間的推移，四聚體的比例減少，而單體的比例增加，直到在大約一小時(shí)的培養(yǎng)后達(dá)到質(zhì)量平衡。二聚體的比例隨時(shí)間大致保持不變。為了生理相關(guān)性，樣品在37°C下培養(yǎng)；質(zhì)量光度計(jì)測(cè)量在室溫下進(jìn)行。在這里，質(zhì)量光度計(jì)提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法來評(píng)估所需的孵育時(shí)間，以確保隨后的實(shí)驗(yàn)在平衡狀態(tài)下進(jìn)行。

量化蛋白質(zhì)濃度如何影響平衡狀態(tài)

一旦低聚體系達(dá)到平衡狀態(tài)，每種蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度將隨著總蛋白質(zhì)濃度的變化而變化。通常，總濃度的增加將有利于形成高階蛋白質(zhì)復(fù)合物，而減少將有利于單體或低階低聚物。質(zhì)量光度計(jì)測(cè)定數(shù)據(jù)證實(shí)了研究中重組蛋白的這一預(yù)期：?jiǎn)误w在總蛋白濃度為1-50 nM時(shí)Zui豐富，四聚體在100 nM時(shí)Zui豐富（圖2）。盡管總蛋白濃度發(fā)生變化，但二聚體比例大致保持不變。在上述示例中，質(zhì)量光度計(jì)有效地測(cè)量了生理相關(guān)蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)每個(gè)低聚物物種的相對(duì)豐度。這種測(cè)量非常有用，因?yàn)榈途畚餇顟B(tài)通常與蛋白質(zhì)活性直接相關(guān)。因此，樣本中低聚物狀態(tài)的知識(shí)可以為下游應(yīng)用的決策提供信息。

評(píng)估環(huán)境因素如何影響平衡

環(huán)境的物理和化學(xué)性質(zhì)——如溫度、離子強(qiáng)度或pH值——會(huì)影響蛋白質(zhì)相互作用的平衡。將平衡的重組蛋白樣品從37°C移至較低溫度（室溫）會(huì)擾亂系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致四聚體的相對(duì)比例隨時(shí)間增加（圖3A）。二聚體的比例再次保持不變（數(shù)據(jù)未顯示）。

這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制溫度和孵育時(shí)間的重要性，并證明快速質(zhì)量光度計(jì)測(cè)量對(duì)于驗(yàn)證所研究系統(tǒng)的狀態(tài)很有價(jià)值。相反，當(dāng)重組蛋白在水中而不是在PBS中培養(yǎng)時(shí)，單體和四聚體數(shù)量的變化不太明顯。出乎意料的是，我們觀察到二聚體數(shù)量顯著增加，盡管存在其他干擾，但在PBS稀釋樣品中二聚體數(shù)量先前保持不變（圖3B），這說明了通過質(zhì)量光度計(jì)進(jìn)行單分子方法量化每個(gè)組分的重要性。

總的來說，對(duì)重組蛋白的三組測(cè)量表明，使用質(zhì)量光度計(jì)在單個(gè)分子水平上監(jiān)測(cè)樣本中的所有蛋白質(zhì)物種，可以對(duì)難以分析的多步驟反應(yīng)提供有價(jià)值的見解。

總結(jié)

涉及蛋白質(zhì)相互作用和其他大分子相互作用的系統(tǒng)通常很復(fù)雜，使得體積測(cè)量難以解釋。由于其單分子性質(zhì)，質(zhì)量光度計(jì)通過提供樣品中所有組分的信息克服了這一挑戰(zhàn)（前提是感興趣組分之間的分子質(zhì)量存在足夠的差異）。質(zhì)量光度計(jì)可在一定時(shí)間或條件下輕松監(jiān)測(cè)溶液中樣品所有組分的相對(duì)濃度，無需任何蛋白質(zhì)標(biāo)記或固定。在這種方法的基礎(chǔ)上，最近發(fā)表的文章詳細(xì)描述了從質(zhì)量光度計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算平衡常數(shù)。